Ana-1小鼠巨噬細胞的原代培養(yǎng)及實驗步驟
Ana-1小鼠巨噬細胞的原代培養(yǎng)及實驗步驟
(1) (Ana-1小鼠巨噬細胞)實驗開始前向小鼠腹腔注射0.5ml含40μg刀豆球蛋白a的磷酸鹽緩沖液（PBS）。
(2) 3天后，斷頸處死小鼠，75%酒精消毒小鼠皮膚。
(3) 置動物于解剖臺上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁。
(4) 再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml 無菌PBS液注入腹腔中，同時從兩側用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內充分流動。
(5) 用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內。
(6) 小心拔出針頭，把液體注入離心管中，1000r/min 4℃離心10分鐘，棄去上清液，重復兩次，加入完全培養(yǎng)液重懸。
(7) 將濾液進行臺盼藍拒染試驗,(Ana-1小鼠巨噬細胞)血細胞計數(shù)板鏡下計數(shù)。以 8.0 ×104至 1.0 ×105/mL的密度將細胞以 400μl/孔接種到預先用L-多聚賴氨酸包被的24 孔培養(yǎng)板或 100μl/孔接種 96 孔培養(yǎng)板。
(8) 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)24-48 h直到融合。
注意事項：
腹腔注射時PBS可以用20ML注射器，每只老鼠注射10ML；切勿注射入內臟，會使腹腔液中紅細胞增多，同時可能污染；注射后，要多揉一下再取液；
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